희석액, 동해방지제 및 동결속도가 붉바리(Epinephelus akaara) 정자의 동결보존에 미치는 영향 = Effects of diluents, cryopretective agents and freezing speeds for sperm cryopreservation of Epinephelus akaara
저자
발행사항
무안 : 목포대학교 대학원, 2017
학위논문사항
학위논문(석사)-- 목포대학교 대학원 : 해양수산자원학과 2017. 2
발행연도
2017
작성언어
한국어
주제어
발행국(도시)
전라남도
형태사항
x, 35 p. ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 임한규
소장기관
This study was conducted to investigate on various factors including types and concentrations of cryoprotective agents (CPAs), diluents and freezing rates with an aim of developing an optimum sperm cryopreservation protocol for Epinephelus akaara.
In the experiments using CPA 10% DMSO and various types of diluents, we observed that 10% DMSO + 300 mM glucose resulted in the highest post-thaw sperm mobility with a MSR of 85.0±2.9%, but the result was not significantly different from that of the 10% DMSO + 300 mM sucrose group (P>0.05). In the experiment using CPA 10% glycerol, the combination with 300 mM sucrose revealed a significantly higher post-thaw sperm mobility than the combinations using other diluents with a MSR of 73.3±1.7% and the next effective diluent was found to be 300 mM glucose (P<0.05). As seen in the experiment using CPA 10% DMSO, diluents ASP and 1% NaCl produced much lower MSR values. In the experiments using CPA 10% methanol, the post-thaw sperm had no mobility regardless of the type of diluents with similar levels of SAI as well as MSR among different diluent groups. We also investigated the effect of CPA concentrations on the post-thaw sperm mobility using CPAs glycerol and DMSO and diluent 300 mM glucose and found that both CPAs had the highest MSR and SAI value at 10% concentration. In an investigation to find the post-thaw sperm survival rate depending on the concentration of CPAs glycerol and DMSO, both CPAs did not have significantly different survival rates among 5, 10, 15 and 20% concentration groups (P>0.05), however the sperm survival rate was significantly low in the 0% group (P<0.05). We also investigated fertilization and hatching rates of post-thaw sperm of E. akaara in different concentrations of CPAs and found the fertilization rate was the highest at 66.7±6.1% in 15% of glycerol and at 81.4±4.3% in 10% DMSO. The hatching rate was also the highest at 27.8±2.3% in the 15% group among the all glycerol concentration groups (P<0.05), and in the case of DMSO, the hatching rate was highest with 40.1±0.4% in the 10% group. The literature study revealed that the combination of diluent 300 mM glucose + CPA 10% DMSO is the most effective for sperm cryopreservation. According to the investigation on the effect of freezing rates of this combination on the post-thaw sperm mobility, the post-thaw sperm had the highest mobility at a freezing rate of -5℃/min.
In conclusion, the optimum rates of post-thaw sperm mobility, fertilization and hatching were achieved when the E. akaara sperm was cryopreserved in the diluent 300 mM glucose and CPA 10% DMSO at a freezing rate of -5℃/min. It is therefore expected that this protocol can be used to cryopreserve E. akaara sperm.
붉바리(Epinephelus akaara) 정자의 동결보존방법을 개발하기 위하여 동해방지제(cryoprotective agent, CPA)의 종류 및 농도, 희석액, 동결 속도 등의 요인들을 조사하여 적정 동결조건을 확립하였다.
동해방지제로 10% DMSO에 여러 종류의 희석액을 사용하여 동결한 정액을 해동하여 정자의 활성을 관찰한 결과, MSR은 300 mM glucose에서 85.0±2.9%로 가장 높았지만, 300 mM sucrose와는 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05). 그러나 1% NaCl과 ASP를 희석액으로 사용한 경우 정자의 활성이 매우 낮았다. 동해방지제로 10% glycerol을 사용한 경우 300 mM sucrose에서 MSR이 73.3±1.7%로 다른 희석액들 보다 유의하게 높은 값을 보였으며, 다음은 300 mM glucose를 희석액으로 사용한 경우였다(P<0.05). 희석액으로 ASP와 1% NaCl을 사용한 경우 동해방지제로 10% DMSO를 사용한 실험처럼 MSR이 매우 낮은 값을 보였다. 동해방지제로 10% methanol를 사용한 경우에서는 모든 희석액에서 정자의 활성을 관찰할 수 없었다. 모든 실험에서 SAI 역시 MSR과 비슷한 경향을 보였다. 희석액으로 300 mM glucose를 선정하고 동해방지제로 glycerol과 DMSO의 농도를 각기 달리하여 해동한 정자의 활성을 조사한 결과 glycerol과 DMSO 모두 10% 농도에서 MSR과 SAI 값이 가장 높게 나타났다. 동해방지제로 glycerol과 DMSO를 사용한 경우 동해방지제의 농도별 정자의 생존율을 관찰하였을 때 glycerol과 DMSO 모두 5, 10, 15, 20% 농도 실험구 사이에서는 생존율에 유의한 차이를 보이지 않았지만(P>0.05), 0% 농도 실험구는 다른 실험구들보다 유의하게 낮은 값을 보였다(P<0.05). 동해방지제의 농도별로 동결보존 한 후 해동한 정자를 이용하여 수정률과 부화율을 조사한 결과, glycerol을 동해방지제로 사용한 경우 15% 농도에서 수정률이 66.7±6.1%로 가장 높은 값을 보였고, DMSO의 경우 10% 농도에서 81.4±4.3%로 가장 높은 값을 보였다. 부화율도 수정률과 같이 glycerol은 15% 농도에서 27.8±2.3%로 다른 실험구들보다 유의하게 높았으며(P<0.05), DMSO는 10% 농도에서 40.1±0.4%로 모든 실험구들 중 가장 높은 값을 보였다. 선행 연구 결과 동결보존 효과가 가장 좋았던 희석액과 동해방지제인 300 mM glucose와 10% DMSO를 사용하여 적정 동결속도를 조사한 결과, 해동한 정자의 활성은 –5℃/min에서 가장 높은 값을 보였다.
이상의 결과들을 종합하면 붉바리 정자의 동결보존을 위해서는 희석액으로 300 mM glucose과 동해방지제로 10% DMSO를 사용하고 분당 –5℃씩 온도를 낮추어 1차 동결 시켰을 때 해동 후 정자의 활성과 수정률 및 부화율이 가장 좋았다. 따라서 이 방법은 향후 붉바리 정자의 동결보존을 위한 방법으로 활용 가능할 것이다.
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